DNT hibridləşməsinin əsasında nə dayanır? İki zəncirli DNT ardıcıllığı fizioloji şəraitdə ümumiyyətlə sabit olsa da, laboratoriyada bu şərtlərin dəyişdirilməsi (adətən ətraf mühitin temperaturunu yüksəltməklə) molekulların ayrı-ayrı zəncirlərə ayrılmasına səbəb olacaq. Sonuncular bir-birini tamamlayır, lakin onların mühitində mövcud olan digər ardıcıllıqları da tamamlaya bilər. Ətraf mühitin temperaturunun aşağı salınması tək zəncirli molekulların bir-biri ilə bağlanmasına və ya "hibridləşməsinə" imkan verir. Bu, DNT hibridləşdirmə üsuludur.
Molekulyar biologiya nöqteyi-nəzərindən konsepsiya
Həm DNT replikasiyasında, həm də DNT-nin RNT-yə transkripsiyasında iştirak edən elm adamları nukleotid krossoverlərinə və molekulyar biologiya üsullarına etibar edirlər. Buraya Cənubi və Şimal ləkələri, polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR) və əksər DNT-RNT hibridizasiyası və ardıcıllıq yanaşmaları daxildir.
Tətbiq
Hibridləşmə nukleotidin əsas xüsusiyyətidirardıcıllığı və molekulyar biologiyanın çoxsaylı üsullarında istifadə olunur. İki növün ümumi genetik əlaqəsi onların DNT seqmentlərinin hibridləşdirilməsi (DNT-DNT hibridləşməsi) ilə müəyyən edilə bilər. Yaxın qohum orqanizmlər arasında ardıcıl oxşarlıqlara görə belə DNT hibridlərini əritmək üçün daha uzaq orqanizmlərlə müqayisədə daha yüksək temperatur tələb olunur. Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) daxil olmaqla, DNT nümunəsinin mənşəyini müəyyən etmək üçün müxtəlif üsullar hibridləşmədən istifadə edir. Başqa bir üsulda, qısa DNT ardıcıllıqları ifadə olunan genləri müəyyən etmək üçün hüceyrə mRNT-yə hibridləşdirilir. Əczaçılıq şirkətləri ribosomun mRNT-ni zülala çevirməsinin qarşısını alaraq, arzuolunmaz mRNT-yə bağlanmaq üçün antisens RNT-nin istifadəsini araşdırır.
DNT-DNT hibridizasiyası ümumiyyətlə DNT ardıcıllığının hovuzları arasında genetik oxşarlıq dərəcəsini ölçən molekulyar biologiya texnikasına istinad edir. İki orqanizm arasındakı genetik məsafəni təyin etmək üçün ümumiyyətlə istifadə olunur. O, filogeniya və taksonomiyada geniş istifadə olunub.
Metodika
Bir orqanizmin DNT-si etiketləndi, sonra onunla müqayisə oluna bilən etiketsiz DNT ilə qarışdırıldı. Qarışıq DNT zəncirlərinin ayrılmasına imkan vermək üçün inkubasiya edilir və sonra regenerasiya edilmiş hibrid ikiqat zəncirli DNT yaratmaq üçün soyudulur. Yüksək dərəcədə oxşarlığa malik hibridləşdirilmiş ardıcıllıqlar daha sıx bağlanacaq və onları ayırmaq üçün daha çox enerji tələb edəcək: yəni daha yüksək temperaturda qızdırıldıqda ayrılırlar.fərqli ardıcıllıqlardan fərqli temperatur, "DNT əriməsi" kimi tanınan proses.
DNT əriməsi
Hibridləşdirilmiş DNT-nin ərimə profilini qiymətləndirərkən, ikiqat zəncirli DNT "sütun" deyilən yerə bağlanır və nəticədə yaranan qarışıq qızdırılır. Hər addımda sütun yuyulur və əriyən DNT ardıcıllığı tək zəncirli olur və sütundan yuyulur. Etiketlənmiş DNT-nin sütundan çıxdığı temperaturlar ardıcıllıqlar arasındakı oxşarlığın miqdarını əks etdirir (və öz-özünə qatlanan model nəzarət rolunu oynayır). Bu nəticələr orqanizmlər arasında genetik oxşarlıq dərəcəsini müəyyən etmək üçün birləşdirilir. Müasir mikrobiologiyaya görə, bunları anlamadan DNT hibridləşməsi mümkün deyil.
Birdən çox ribonuklein turşusu (və ya dezoksiribonuklein) turşu növləri bu şəkildə müqayisə edildikdə, oxşarlıq dəyərləri növlərin filogenetik ağacda yerləşdirilməsinə imkan verir. Buna görə də bu, molekulyar sistematikanın aparılması üçün mümkün yanaşmalardan biridir. Bu texnikanın qabaqcılları olan Charles Sibley və John Ahlquist, quşların (Sibley-Ahlquist taksonomiyası) və primatların filogenetik əlaqələrini öyrənmək üçün DNT-DNT hibridləşməsindən istifadə etdilər.
Biologiya üçün əhəmiyyət
DNT-DNT hibridləşməsi bakterial növlərin fərqləndirilməsi üçün qızıl standartdır, oxşarlıq dəyəri 70%-dən çox olmaqla, müqayisə edilən suşların müxtəlif növlərə aid olduğunu göstərir. 2014-cü ildə bakterial alt növü ayırmaq üçün 79% oxşarlıq həddi təklif edilmişdir.
Tənqidçilər bu texnikanın yaxın qohum növlərin müqayisəsi üçün qeyri-dəqiq olduğunu iddia edirlər, çünki orqanizmlər arasında ortoloji ardıcıllıqlar arasındakı fərqləri ölçmək cəhdi orqanizmin genomunda paraloq analoqların hibridləşməsi ilə üst-üstə düşür. DNT ardıcıllığı və hesablama ardıcıllığının müqayisəsi hazırda genetik məsafənin müəyyən edilməsi üçün çox istifadə edilən üsuldur, baxmayaraq ki, bu yanaşma hələ də mikrobiologiyada bakteriyaları müəyyən etmək üçün istifadə olunur.
Mövcud yol tam və ya qismən ardıcıl genomlardan istifadə edərək silikonda DNT-DNT hibridləşməsini aparmaqdır. DSMZ tərəfindən hazırlanmış GGDC GDH kimi dəyərlərin hesablanması üçün ən dəqiq məlum alətdir. Digər alqoritmik təkmilləşdirmələr arasında o, iki genom ardıcıllığı arasındakı uyğunluqlardan diqqətlə süzülərək paraloq ardıcıllıqla bağlı problemi həll edir.
BALIQ üsulu
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) tez-tez spesifik xromosomda DNT-ni aşkar etmək və ardıcıllaşdırmaq üçün istifadə edilən laboratoriya texnikasıdır.
1969-cu ildə Cozef Qall və Meri Lou Pardu ribosomal DNT ardıcıllığının radioaktiv nüsxələrinin qurbağa yumurtasının nüvəsindəki tamamlayıcı DNT ardıcıllığını aşkar etmək üçün istifadə oluna biləcəyini nümayiş etdirən bir məqalə dərc etdilər. Bu orijinal müşahidələrdən bəri bir çox təkmilləşdirmələr çox yönlü və artmışdırprosedurun o dərəcədə həssaslığı ki, in situ hibridləşmə ("yerində", latın) indi sitogenetikada mühüm alət hesab olunur. (İndi in situ termini həm də patoloji prosesdə yalnız epitel toxumasının iştirak etdiyi karsinoma böyüməsinin ilkin mərhələsinə aid edilir.)
Flüoresan hibridləşmə ardıcıllığı
RNT zondları toxumalarda və hüceyrələrdə lncRNA və miRNA mRNA-nı vizuallaşdırmaq üçün hər hansı gen və ya gen daxilindəki hər hansı ardıcıllıq üçün hazırlana bilər. FISH hüceyrə çoxalma dövrünü, xüsusən də hər hansı xromosom anomaliyaları üçün nüvə interfazasını öyrənmək üçün istifadə olunur. FISH sizə arxiv işlərinin böyük seriyasını təhlil etməyə imkan verir, oxşar xromosomları cəlb edəcək süni xromosom bazası olan zond yaratmaqla müəyyən edilmiş xromosomu müəyyən etmək çox asandır.
Nüvə anormallığı aşkar edildikdə hər bir zond üçün hibridləşmə siqnalları: hər bir mRNT və lncRNA aşkarlama zondu 20 cüt oliqonukleotiddən ibarətdir, hər bir cüt 40-50 bp boşluğu əhatə edir. p. Zondlar mRNT-ni aşkar etmək üçün xüsusi kimyadan istifadə edir.
DNT zondları ilə hibridləşmə
Zondlar çox vaxt insan genomunun dizaynında istifadə üçün təcrid olunmuş, təmizlənmiş və gücləndirilmiş DNT fraqmentlərindən hazırlanır. İnsan genomunun ölçüsü birbaşa ardıcıllıqla təyin oluna bilən uzunluqla müqayisədə o qədər böyükdür ki, onu aşağıdakılara bölmək lazımdır.fraqmentlər. Nəhayət, bu fraqmentlər, böyük fraqmentlərin bir-biri ilə üst-üstə düşdüyünü müəyyən etmək üçün bu məlumatdan istifadə edərək, ölçü istisna xromatoqrafiyasından istifadə etməklə hər bir kiçik fraqmentin ölçüsünü ölçmək üçün ardıcıllıqla xüsusi endonükleazlardan istifadə etməklə hər bir fraqmentin bir nüsxəsini daha kiçik vahidlərə həzm etməklə sifariş edildi..
Elementləri fərdi DNT ardıcıllığı ilə qorumaq üçün fraqmentlər daim təkrarlanan bakteriya populyasiyaları sisteminə əlavə edildi. Bakteriyaların klonal populyasiyaları, hər bir populyasiyada tək süni xromosom saxlanılır, dünyanın müxtəlif laboratoriyalarında saxlanılır. Süni xromosomlar (BAC) kitabxanası olan istənilən laboratoriyada yetişdirilə, çıxarıla və etiketlənə bilər. Genomik kitabxanalar çox vaxt inkişaf etdirildikləri qurumların adını daşıyır. Buna misal olaraq Buffaloda (Nyu-York, ABŞ) Roswell Xərçəng İnstitutunun adını daşıyan RPCI-11 kitabxanasını göstərmək olar. Bu fraqmentlər təxminən 100 min baza cütünü təşkil edir və əksər FISH zondlarının əsasını təşkil edir.
