Protein bütün orqanizmlərin vacib komponentidir. Onun molekullarının hər biri amin turşularından ibarət bir və ya bir neçə polipeptid zəncirindən ibarətdir. Həyat üçün zəruri olan məlumatların DNT və ya RNT-də kodlanmasına baxmayaraq, rekombinant zülallar orqanizmlərdə fermentativ kataliz, qoruma, dəstək, hərəkət və tənzimləmə daxil olmaqla geniş bioloji funksiyaları yerinə yetirir. Bədəndəki funksiyalarına görə, bu maddələr antikorlar, fermentlər, struktur komponentlər kimi müxtəlif kateqoriyalara bölünə bilər. Onların mühüm funksiyalarını nəzərə alaraq, bu cür birləşmələr intensiv şəkildə öyrənilmiş və geniş istifadə edilmişdir.
Keçmişdə rekombinant zülal əldə etməyin əsas yolu onu təbii mənbədən təcrid etmək idi ki, bu da adətən səmərəsiz və çox vaxt aparır. Bioloji molekulyar texnologiyada son nailiyyətlər müəyyən maddələr dəstini kodlayan DNT-ni bakteriya, maya, həşərat hüceyrələri və məməlilər hüceyrələri kimi maddələrin ifadə vektoruna klonlamağa imkan verib.
Sadə dillə desək, rekombinant zülallar ekzogen DNT məhsulları ilə çevrilircanlı hüceyrələr. Onları əldə etmək adətən iki əsas addımı əhatə edir:
- Molekulun klonlanması.
- Protein ifadəsi.
Hazırda belə bir quruluşun istehsalı tibb və biologiyada istifadə edilən ən güclü üsullardan biridir. Kompozisiyanın tədqiqat və biotexnologiyada geniş tətbiqi var.
Tibbi istiqamət
Rekombinant zülallar diabet, xərçəng, yoluxucu xəstəliklər, hemofiliya və anemiya kimi müxtəlif xəstəliklər üçün mühüm müalicələr təmin edir. Bu cür maddələrin tipik formulalarına antikorlar, hormonlar, interleykinlər, fermentlər və antikoaqulyantlar daxildir. Terapevtik istifadə üçün rekombinant formulalara artan ehtiyac var. Onlar sizə müalicə üsullarını genişləndirməyə imkan verir.
genetik cəhətdən yaradılmış rekombinant zülallar terapevtik dərman bazarında əsas rol oynayır. Hal-hazırda məməlilərin hüceyrələri ən çox müalicəvi maddələr istehsal edir, çünki onların formulaları yüksək keyfiyyətli, təbii kimi maddələr istehsal etməyə qadirdir. Bundan əlavə, yaxşı genetika, sürətli böyümə və yüksək məhsuldarlığa görə E. coli-də bir çox təsdiqlənmiş rekombinant terapevtik zülallar istehsal olunur. Bu maddə əsasında hazırlanan dərmanların hazırlanmasına da müsbət təsir göstərir.
Araşdırma
Rekombinant zülalların əldə edilməsi müxtəlif üsullara əsaslanır. Maddələr bədənin əsas və əsas prinsiplərini tapmağa kömək edir. Bu molekullar müəyyən etmək və təyin etmək üçün istifadə edilə bilərmüəyyən bir gen tərəfindən kodlanan maddənin yeri və məqalədə müzakirə olunan birləşmələrin hüceyrə siqnalı, metabolizm, böyümə, təkrarlanma və ölüm, transkripsiya, tərcümə və modifikasiya kimi müxtəlif hüceyrə fəaliyyətlərində digər genlərin funksiyasını aşkar etmək.
Beləliklə, müşahidə edilən tərkib tez-tez molekulyar biologiya, hüceyrə biologiyası, biokimya, struktur və biofiziki tədqiqatlar və bir çox digər elm sahələrində istifadə olunur. Eyni zamanda, rekombinant zülalların əldə edilməsi beynəlxalq təcrübədir.
Belə birləşmələr hüceyrələrarası qarşılıqlı əlaqəni başa düşmək üçün faydalı vasitədir. Onların ELISA və immunohistokimya (IHC) kimi bir neçə laboratoriya üsullarında effektivliyi sübut edilmişdir. Rekombinant zülallar ferment analizlərini inkişaf etdirmək üçün istifadə edilə bilər. Bir cüt uyğun antikor ilə birlikdə istifadə edildikdə, hüceyrələr yeni texnologiyalar üçün standart kimi istifadə edilə bilər.
Biotexnologiya
Tərkibində amin turşusu ardıcıllığı olan rekombinant zülallar sənaye, qida istehsalı, kənd təsərrüfatı və biomühəndislikdə də istifadə olunur. Məsələn, heyvandarlıqda yem inqrediyentlərinin qida dəyərini artırmaq, xərcləri və tullantıları az altmaq, heyvan bağırsaqlarının sağlamlığını dəstəkləmək, məhsuldarlığı artırmaq və ətraf mühiti yaxşılaşdırmaq üçün fermentlər qidaya əlavə edilə bilər.
Bundan əlavə, uzun müddət laktik turşu bakteriyaları (LAB).fermentləşdirilmiş qidaların istehsalı üçün istifadə edilmişdir və bu yaxınlarda LAB, məsələn, insan, heyvan və qida həzmini yaxşılaşdırmaq üçün geniş şəkildə istifadə edilə bilən amin turşusu ardıcıllığını ehtiva edən rekombinant zülalların ifadəsi üçün hazırlanmışdır.
Lakin bu maddələrin də məhdudiyyətləri var:
- Bəzi hallarda rekombinant zülalların istehsalı mürəkkəb, bahalı və vaxt aparır.
- Hüceyrələrdə istehsal olunan maddələr təbii formalara uyğun gəlməyə bilər. Bu fərq terapevtik rekombinant zülalların effektivliyini azalda bilər və hətta yan təsirlərə səbəb ola bilər. Bundan əlavə, bu fərq təcrübələrin nəticələrinə təsir edə bilər.
- Bütün rekombinant dərmanların əsas problemi immunogenlikdir. Bütün biotexnoloji məhsullar müəyyən formada immunogenlik nümayiş etdirə bilər. Yeni terapevtik zülalların təhlükəsizliyini proqnozlaşdırmaq çətindir.
Ümumiyyətlə, biotexnologiyada irəliləyişlər müxtəlif tətbiqlər üçün rekombinant zülalların istehsalını artırmış və asanlaşdırmışdır. Onların hələ də bəzi çatışmazlıqları olsa da, maddələr tibb, tədqiqat və biotexnologiyada vacibdir.
Xəstəlik linki
rekombinant zülal insanlar üçün zərərli deyil. Müəyyən bir dərman və ya qida elementinin inkişafında ümumi molekulun yalnız ayrılmaz hissəsidir. Bir çox tibbi araşdırmalar göstərdi ki, şişman siçanların laboratoriya ştammında FGFBP3 zülalının (qısaldılmış BP3) məcburi ifadəsi onların bədən yağında əhəmiyyətli azalma göstərdi.istifadə üçün genetik meylinə baxmayaraq kütləvi.
Bu sınaqların nəticələri göstərir ki, FGFBP3 zülalı tip 2 diabet və yağlı qaraciyər xəstəliyi kimi metabolik sindromla əlaqəli xəstəliklər üçün yeni terapiya təklif edə bilər. Lakin BP3 süni dərman deyil, təbii zülal olduğundan, rekombinant insan BP3-ün klinik sınaqları preklinik tədqiqatların son mərhələsindən sonra başlaya bilər. Yəni, bu cür tədqiqatların aparılmasının təhlükəsizliyi ilə bağlı səbəblər var. Rekombinant zülalın mərhələli işlənməsi və təmizlənməsi sayəsində insanlar üçün zərərli deyil. Dəyişikliklər molekulyar səviyyədə də baş verir.
İmmunoterapiyanın əsas oyunçularından biri olan PD-L2 2018-ci il Fiziologiya və Tibb üzrə Nobel Mükafatına namizəd göstərilmişdir. ABŞ-dan professor Ceyms P. Allison və Yaponiyadan Prof. Bu yaxınlarda AMSBIO immunoterapiya xəttinə əsas yeni məhsulu, PD-L2/TCR aktivatorunu - CHO Rekombinant Hüceyrə Xəttini əlavə etdi.
Konsepti sübut edən eksperimentlərdə, Birmingemdəki Alabama Universitetinin tədqiqatçıları H. Long Zheng, MD, professor Robert B. Adams və UAB Məktəbinin Patologiya Departamentinin Laboratoriya Tibbinin direktoru Tibb nadir, lakin ölümcül qanaxma pozğunluğu olan TTP-nin potensial terapiyasını vurğuladı.
Bunun nəticələritədqiqatlar ilk dəfə göstərir ki, rADAMTS13 yüklü trombositlərin transfuziyası anadangəlmə və immun vasitəli TTP ilə əlaqəli arterial tromboz üçün yeni və potensial olaraq effektiv terapevtik yanaşma ola bilər.
Rekombinant zülal təkcə qida maddəsi deyil, həm də hazırlanmaqda olan preparatın tərkibində dərmandır. Bunlar hazırda tibbdə iştirak edən və onun bütün struktur elementlərinin öyrənilməsi ilə bağlı olan bir neçə sahədir. Beynəlxalq təcrübənin göstərdiyi kimi, maddənin quruluşu molekulyar səviyyədə insan orqanizmində bir çox ciddi problemlərlə mübarizə aparmağa imkan verir.
Peyvənd inkişafı
Rekombinant zülal modelləşdirilə bilən xüsusi molekullar dəstidir. Bənzər bir xüsusiyyət peyvəndlərin hazırlanmasında istifadə olunur. Edinburq Universiteti və Pirbrayt İnstitutunun tədqiqatçıları bildiriblər ki, xüsusi rekombinant virus inyeksiyasının istifadəsi kimi də tanınan yeni peyvənd strategiyası risk altında olan milyonlarla toyuqları ciddi tənəffüs xəstəliklərindən qoruya bilər. Bu peyvəndlər mikrobları orqanizmin hüceyrələrinə daxil etmək üçün virus və ya bakteriyanın zərərsiz və ya zəif versiyalarından istifadə edir. Bu halda mütəxəssislər zərərsiz virusun iki versiyasını yaratmaq üçün peyvənd kimi müxtəlif sünbül zülalları olan rekombinant viruslardan istifadə ediblər. Bu əlaqə ətrafında qurulmuş çoxlu müxtəlif dərmanlar var.
Rekombinant protein ticarət adları və analoqları aşağıdakılardır:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Bunlar əsasən xərçəng əleyhinə dərmanlardır, lakin bu aktiv maddə ilə əlaqəli başqa müalicə sahələri də var.
Nature Communications elmi jurnalında dərc olunmuş yeni araşdırmaya görə, insanları həm Lassa qızdırması, həm də quduzluqdan qorumaq üçün nəzərdə tutulmuş LASSARAB adlı yeni peyvənd preklinik tədqiqatlarda ümidverici nəticələr göstərib. İnaktivləşdirilmiş rekombinant peyvənd namizədi zəifləmiş quduz virusundan istifadə edir.
Tədqiqat qrupu Lassa virusunun genetik materialını quduz virus vektoruna daxil etdi ki, peyvənd həm Lassa, həm də quduz hüceyrələrində səth zülallarını ifadə etsin. Bu səth birləşmələri yoluxucu agentlərə qarşı immun reaksiya yaradır. Bu peyvənd daha sonra daşıyıcı yaratmaq üçün istifadə edilən canlı quduz virusunu "məhv etmək" üçün təsirsiz hala gətirildi.
Alma Metodları
Maddə istehsalı üçün bir neçə sistem var. Rekombinant zülal əldə etməyin ümumi üsulu sintezdən bioloji material əldə etməyə əsaslanır. Amma başqa yollar da var.
Hazırda beş əsas ifadə sistemi var:
- E. coli ifadə sistemi.
- Maya ifadə sistemi.
- Böcək hüceyrəsi ifadə sistemi.
- Mməli hüceyrə ifadə sistemi.
- Hüceyrəsiz protein ifadə sistemi.
Sonuncu seçim transmembran zülalların ifadəsi üçün xüsusilə uyğundurvə zəhərli birləşmələr. Son illərdə ənənəvi hüceyrədaxili üsullarla ifadəsi çətin olan maddələr in vitro şəraitində uğurla hüceyrələrə inteqrasiya edilmişdir. Belarusiyada rekombinant zülalların istehsalı geniş istifadə olunur. Bu məsələ ilə məşğul olan bir sıra dövlət müəssisələri var.
Hüceyrəsiz Zülal Sintez Sistemi hüceyrə ekstraktlarının enzimatik sistemində transkripsiya və tərcümə üçün lazım olan müxtəlif substratları və enerji birləşmələrini əlavə etməklə hədəf maddələrin sintezi üçün sürətli və səmərəli üsuldur. Son illərdə mürəkkəb, zəhərli membranlar kimi maddələrin növləri üçün hüceyrəsiz üsulların üstünlükləri tədricən ortaya çıxdı və onların biofarmasevtika sahəsində potensial tətbiqini nümayiş etdirdi.
Hüceyrəsiz texnologiya adi rekombinant ifadədən sonra həlli çətin olan mürəkkəb modifikasiya proseslərinə nail olmaq üçün asanlıqla və idarə olunan şəkildə müxtəlif qeyri-təbii amin turşularını əlavə edə bilər. Bu cür üsullar yüksək tətbiq dəyərinə və virusa bənzər hissəciklərdən istifadə edərək dərmanların çatdırılması və peyvəndin inkişafı üçün potensiala malikdir. Çoxlu sayda membran zülalları sərbəst hüceyrələrdə uğurla ifadə edilmişdir.
Bəstələrin ifadəsi
Rekombinant protein CFP10-ESAT 6 istehsal olunur və peyvənd yaratmaq üçün istifadə olunur. Belə bir vərəm alerjeni immunitet sistemini gücləndirməyə və antikorları inkişaf etdirməyə imkan verir. Ümumiyyətlə, molekulyar tədqiqatlar zülalın strukturu, funksiyası, modifikasiyası, lokalizasiyası və ya qarşılıqlı təsiri kimi hər hansı aspektinin öyrənilməsini əhatə edir. Tədqiq etməkxüsusi maddələr daxili prosesləri necə tənzimləyir, tədqiqatçılar adətən maraq və fayda verən funksional birləşmələr istehsal etmək üçün vasitə tələb edir.
Zülalların ölçüsünü və mürəkkəbliyini nəzərə alsaq, kimyəvi sintez bu cəhd üçün uyğun variant deyil. Əvəzində canlı hüceyrələr və onların hüceyrə mexanizmləri təqdim olunan genetik şablonlar əsasında maddələr yaratmaq və qurmaq üçün adətən fabrik kimi istifadə olunur. Rekombinant zülal ifadə sistemi daha sonra dərman yaratmaq üçün lazımi strukturu yaradır. Sonra müxtəlif kateqoriyalı dərmanlar üçün lazımi materialın seçimi gəlir.
Zülallardan fərqli olaraq, DNT-ni yaxşı qurulmuş rekombinant üsullardan istifadə edərək sintetik və ya in vitro şəkildə qurmaq asandır. Buna görə də, spesifik genlərin DNT şablonları, əlavə məruzəçi ardıcıllığı və ya yaxınlıq etiketi ardıcıllığı ilə və ya olmayan, monitorinq edilən maddənin ifadəsi üçün şablonlar kimi tərtib edilə bilər. Belə DNT şablonlarından əldə edilən bu cür birləşmələr rekombinant zülallar adlanır.
Maddənin ifadəsi üçün ənənəvi strategiyalar şablonu ehtiva edən DNT vektoru ilə hüceyrələrin transfeksiya edilməsini və sonra istədiyiniz zülalın transkripsiya və tərcüməsi üçün hüceyrələrin kultivasiyasını əhatə edir. Tipik olaraq, hüceyrələr daha sonra ifadə olunan birləşməni sonrakı təmizləmə üçün çıxarmaq üçün parçalanır. Rekombinant zülal CFP10-ESAT6 bu şəkildə işlənir və mümkün olanlardan təmizlənmə sistemindən keçir.toksinlərin əmələ gəlməsi. Yalnız bundan sonra o, peyvənd üçün sintez ediləcək.
Molekulyar maddələr üçün həm prokaryotik, həm də eukaryotik in vivo ifadə sistemləri geniş istifadə olunur. Sistemin seçimi zülalın növündən, funksional fəaliyyət tələbindən və istənilən məhsuldan asılıdır. Bu ifadə sistemlərinə məməlilər, həşəratlar, mayalar, bakteriyalar, yosunlar və hüceyrələr daxildir. Hər sistemin öz üstünlükləri və çətinlikləri var və xüsusi tətbiq üçün düzgün sistemin seçilməsi nəzərdən keçirilən maddənin uğurlu ifadəsi üçün vacibdir.
Məmməlilərdən ifadə
Rekombinant zülalların istifadəsi peyvəndlərin və müxtəlif səviyyəli dərmanların hazırlanmasına imkan verir. Bunun üçün bir maddə əldə etməyin bu üsulundan istifadə edilə bilər. Məməlilərin ifadə sistemləri, fizioloji cəhətdən uyğun mühitə görə ən doğma quruluşa və fəaliyyətə malik olan heyvanlar aləmindən zülallar istehsal etmək üçün istifadə edilə bilər. Bu, yüksək səviyyəli tərcümə sonrası emal və funksional fəaliyyətlə nəticələnir. Məməlilərin ifadə sistemləri hüceyrə əsaslı funksional analizlərdə istifadə üçün antikorlar, kompleks zülallar və birləşmələr istehsal etmək üçün istifadə edilə bilər. Bununla belə, bu üstünlüklər daha ciddi mədəniyyət şərtləri ilə birləşdirilir.
Mməlilərin ifadə sistemləri zülalları müvəqqəti olaraq və ya ifadə konstruksiyasının ev sahibi genomuna inteqrasiya olunduğu sabit hüceyrə xətləri vasitəsilə yaratmaq üçün istifadə edilə bilər. Bu cür sistemlər birdən çox təcrübədə istifadə edilə bilsə də, vaxtistehsal bir-iki həftə ərzində böyük miqdarda maddə yarada bilər. Bu tip rekombinant zülal biotexnologiyasına yüksək tələbat var.
Bu keçici, yüksək məhsuldar məməli ifadə sistemləri suspenziya kulturalarından istifadə edir və litr başına qram məhsul verə bilər. Bundan əlavə, bu zülallar digər ifadə sistemləri ilə müqayisədə daha çox yerli qatlama və qlikozilləşmə kimi post-translational modifikasiyalara malikdir.
Böcək İfadəsi
Rekombinant zülal istehsal etmək üsulları məməlilərlə məhdudlaşmır. İstehsal xərcləri baxımından daha məhsuldar yollar da var, baxmayaraq ki, 1 litr təmizlənmiş maye üçün maddənin məhsuldarlığı xeyli aşağıdır.
Böcək hüceyrələrindən məməli sistemlərə bənzər modifikasiyalarla yüksək səviyyəli zülal ifadə etmək üçün istifadə edilə bilər. Rekombinant bakulovirus yaratmaq üçün istifadə oluna bilən bir neçə sistem var ki, bunlar daha sonra həşərat hüceyrələrində maraq doğuran maddəni çıxarmaq üçün istifadə edilə bilər.
Rekombinant zülalların ifadələri asanlıqla böyüdülə bilər və molekulların geniş miqyaslı birləşmələri üçün yüksək sıxlıqlı suspenziya mədəniyyətinə uyğunlaşdırıla bilər. Onlar funksional olaraq məməlilərin materiyasının yerli tərkibinə daha çox bənzəyirlər. Məhsuldarlıq 500 mq/L-ə qədər ola bilsə də, rekombinant bakulovirusun istehsalı çox vaxt apara bilər və mədəniyyət şəraiti prokaryotik sistemlərdən daha çətindir. Ancaq daha cənub və daha isti ölkələrdə oxşardırmetod daha səmərəli hesab olunur.
Bakteriya ifadəsi
Rekombinant zülalların istehsalı bakteriyaların köməyi ilə qurula bilər. Bu texnologiya yuxarıda təsvir edilənlərdən çox fərqlidir. Bakteriyaların zülal ifadə sistemləri populyardır, çünki bakteriyalar asanlıqla becərilir, tez böyüyür və rekombinant formulasiyadan yüksək məhsul verir. Bununla belə, bakteriyalarda ifadə olunan çoxdomenli eukaryotik maddələr tez-tez işləmir, çünki hüceyrələr lazımi post-translational modifikasiyaları və ya molekulyar qatlamaları yerinə yetirmək üçün təchiz olunmur.
Bundan əlavə, bir çox zülallar inklüzyon molekulları kimi həll olunmaz hala gəlir, onları sərt denaturatorlar və sonrakı çətin molekulyar yenidən qatlama prosedurları olmadan bərpa etmək çox çətindir. Bu üsul əsasən hələ də eksperimental hesab olunur.
Hüceyrəsiz ifadə
Stafilokinazın amin turşusu ardıcıllığını ehtiva edən rekombinant zülal bir qədər fərqli şəkildə alınır. O, istifadə etməzdən əvvəl bir neçə sistem tələb edən bir çox inyeksiya növlərinə daxildir.
Hüceyrəsiz zülal ifadəsi translyasiya baxımından uyğun olan bütün hüceyrə ekstraktlarından istifadə edərək maddənin in vitro sintezidir. Prinsipcə, bütün hüceyrə ekstraktları transkripsiya, tərcümə və hətta post-translational modifikasiya üçün tələb olunan bütün makromolekulları və komponentləri ehtiva edir.
Bu komponentlərə RNT polimeraza, tənzimləyici zülal amilləri, transkripsiya formaları, ribosomlar və tRNT daxildir. Əlavə edərkənkofaktorlar, nukleotidlər və spesifik gen şablonu ilə bu ekstraktlar bir neçə saat ərzində maraq doğuran zülalları sintez edə bilər.
Böyük miqyaslı istehsal üçün davamlı olmasa da, hüceyrəsiz və ya in vitro protein ifadəsi (IVT) sistemləri ənənəvi in vivo sistemlərə nisbətən bir sıra üstünlüklər təklif edir.
Hüceyrəsiz ifadə hüceyrə mədəniyyətini cəlb etmədən rekombinant formulaların sürətli sintezinə imkan verir. Hüceyrəsiz sistemlər zülalları dəyişdirilmiş amin turşuları ilə etiketləməyə, həmçinin hüceyrədaxili proteazlar tərəfindən sürətli proteolitik parçalanmaya məruz qalan birləşmələri ifadə etməyə imkan verir. Bundan əlavə, hüceyrəsiz bir üsuldan istifadə edərək eyni vaxtda çoxlu müxtəlif zülalları ifadə etmək daha asandır (məsələn, bir çox müxtəlif rekombinant DNT şablonlarından kiçik miqyaslı ifadə ilə protein mutasiyalarının sınaqdan keçirilməsi). Bu təmsilçi təcrübədə insan kaspaz-3 zülalını ifadə etmək üçün IVT sistemi istifadə edilmişdir.
Nəticələr və gələcək perspektivlər
Rekombinant zülal istehsalı artıq yetkin bir intizam kimi görünə bilər. Bu, təmizləmə və təhlildə çoxsaylı təkmilləşdirmələrin nəticəsidir. Hal-hazırda, dərman kəşfi proqramları, hədəf zülal istehsal edə bilməməsi səbəbindən nadir hallarda dayandırılır. Bir neçə rekombinant maddələrin ifadəsi, təmizlənməsi və təhlili üçün paralel proseslər indi dünyanın bir çox laboratoriyalarında yaxşı məlumdur.
Protein kompleksləri və istehsalda artan uğurhəll olunan membran strukturları tələbi qarşılamaq üçün daha çox dəyişiklik tələb edəcəkdir. Zülalların daha müntəzəm tədarükü üçün effektiv müqavilə tədqiqat təşkilatlarının yaranması bu yeni çağırışlara cavab vermək üçün elmi resursların yenidən bölüşdürülməsinə imkan verəcək.
Əlavə olaraq, paralel iş axınları ənənəvi kiçik molekullu dərmanların kəşfi layihələri ilə yanaşı yeni hədəfin müəyyənləşdirilməsi və təkmil skrininq imkanları üçün monitorinq edilən maddənin tam kitabxanalarının yaradılmasına imkan verməlidir.
