Molekulyar bioloji tədqiqat metodları müasir tibb, məhkəmə ekspertizası və biologiyada böyük rol oynayır. DNT və RNT-nin öyrənilməsində əldə edilən nailiyyətlər sayəsində insan orqanizmin genomunu öyrənə, xəstəliyin törədicini təyin edə, turşular qarışığında arzu olunan nuklein turşusunu tanıya və s.
Molekulyar bioloji tədqiqat üsulları. Bu nədir?
Hələ 70-80-ci illərdə elm adamları ilk dəfə insan genomunu deşifrə etməyi bacardılar. Bu hadisə gen mühəndisliyi və molekulyar biologiyanın inkişafına təkan verdi. DNT və RNT-nin xassələrinin öyrənilməsi ona gətirib çıxardı ki, indi bu nuklein turşularından xəstəlik diaqnozu qoymaq, genləri öyrənmək üçün istifadə etmək mümkündür.
DNT və RNT əldə etmək
Molekulyar bioloji diaqnostika üsulları başlanğıc materialın olmasını tələb edir: daha çox nuklein turşularıdır. Bu maddələri canlı orqanizmlərin hüceyrələrindən təcrid etməyin bir neçə yolu var. Onların hər birinin öz üstünlükləri və mənfi cəhətləri var və bu lazımdırtəmiz nuklein turşularının təcrid edilməsi üsulunu seçərkən nəzərə alın.
1. Marmura görə DNT-nin əldə edilməsi. Metod maddələrin qarışığının spirtlə müalicəsindən ibarətdir, bunun nəticəsində təmiz DNT çöküntüləri əmələ gəlir. Bu metodun dezavantajı aqressiv maddələrin istifadəsidir: fenol və xloroform.
2. Boom görə DNT-nin təcrid edilməsi. Burada istifadə olunan əsas maddə guanidin tiosiyanatdır (GuSCN). Dezoksiribonuklein turşusunun xüsusi substratlarda çökməsinə kömək edir, sonradan xüsusi bir tampondan istifadə edərək toplana bilər. Bununla belə, GuSCN PTC-nin inhibitorudur və onun çöküntülü DNT-yə daxil olan kiçik bir hissəsi belə nuklein turşuları ilə işləməkdə mühüm rol oynayan polimeraza zəncirvari reaksiyasının gedişinə təsir göstərə bilər.
3. Çirklərin çökməsi. Metod əvvəlkilərdən onunla fərqlənir ki, çökən dezoksiribonuklein turşusunun molekulları deyil, çirkləridir. Bunun üçün ion dəyişdiricilərdən istifadə olunur. Dezavantaj odur ki, bütün maddələr çökə bilməz.
4. Kütləvi baxış. Bu üsul DNT molekulunun tərkibi haqqında dəqiq məlumata ehtiyac olmadığı, lakin bəzi statistik məlumatların əldə edilməsi lazım olduğu hallarda istifadə olunur. Bu onunla izah olunur ki, nuklein turşusunun strukturu yuyucu vasitələrlə, xüsusilə qələvilərlə işləndikdə zədələnə bilər.
Tədqiqat metodlarının təsnifatı
Bütün molekulyar bioloji tədqiqat metodları üç böyük qrupa bölünür:
1. Gücləndirmə (bir çox fermentlərdən istifadə etməklə). Budurbir çox diaqnostik metodlarda böyük rol oynayan PCR - polimeraza zəncirvari reaksiyasına aiddir.
2. Gücləndirməyən. Bu üsullar qrupu nuklein turşularının qarışıqlarının işləməsi ilə birbaşa bağlıdır. Nümunələr 3 ləkə, in situ hibridləşdirmə və s.
3. Müəyyən bir zond DNT və ya RNT-yə bağlanan bir zond molekulundan gələn siqnalın tanınmasına əsaslanan üsullar. Məsələn, Hibrid Çəkmə Sistemi (hc2).
Molekulyar biologiya tədqiqat metodlarında istifadə edilə bilən fermentlər
Bir çox molekulyar diaqnostik üsullar geniş çeşiddə fermentlərin istifadəsini nəzərdə tutur. Aşağıda ən çox istifadə olunanlar verilmişdir:
1. Məhdudiyyət fermenti - DNT molekulunu lazımi hissələrə "kəsdirir".
2. DNT polimeraza - dezoksiribonuklein turşusunun ikiqat zəncirli molekulunu sintez edir.
3. Əks transkriptaza (revertaza) - RNT şablonunda DNT sintez etmək üçün istifadə olunur.
4. DNT liqase - nukleotidlər arasında fosfodiester bağlarının formalaşmasından məsuldur.
5. Exonuclease - dezoksiribonuklein turşusu molekulunun terminal bölmələrindən nukleotidləri çıxarır.
PCR DNT gücləndirilməsinin əsas üsuludur
Polimeraza zəncirvari reaksiyası (PZR) müasir molekulyar biologiyada fəal şəkildə istifadə olunur. Bu, tək bir DNT molekulundan çoxlu sayda nüsxənin əldə oluna biləcəyi bir üsuldur (molekullar gücləndirilir).
PCR-nin əsas funksiyaları:
- diaqnostikaxəstəliklər;
- DNT seqmentlərinin, genlərin klonlanması.
Polimeraza zəncirvari reaksiyanı həyata keçirmək üçün aşağıdakı elementlər tələb olunur: ilkin DNT molekulu, termostabil DNT polimeraza (Taq və ya Pfu), deoksiribonukleotid fosfatlar (azotlu əsasların mənbələri), primerlər (1 DNT molekuluna 2 primer).) və bütün reaksiyaların mümkün olduğu bufer sisteminin özü.
PZR üç mərhələdən ibarətdir: denatürasiya, primer yumşalma və uzanma.
1. Denatürasiya. 94-95 dərəcə Selsi temperaturunda DNT-nin iki zəncirindəki hidrogen bağları pozulur və nəticədə iki təkzəncirli molekul əldə edirik.
2. Astarın yumşaldılması. 50-60 dərəcə Selsi temperaturunda primerlər komplementarlıq növü ilə tək zəncirli nuklein turşusu molekullarının uclarına yapışdırılır.
3. Uzatma. 72 dərəcə temperaturda dezoksiribonuklein turşusunun qız ikiqat zəncirli molekullarının sintezi baş verir.
DNT ardıcıllığı
Molekulyar bioloji tədqiqat metodları tez-tez dezoksiribonuklein turşusu molekulunda nukleotid ardıcıllığı haqqında bilik tələb edir. Genetik kodu müəyyən etmək üçün ardıcıllıq aparılır. Gələcəyin molekulyar diaqnostikası insan ardıcıllığından əldə edilən biliyə əsaslanacaq.
Aşağıdakı ardıcıllıq növləri fərqləndirilir:
- Maksam-Gilbert ardıcıllığı;
- Sanger ardıcıllığı;
- pirosekvensləmə;
- nanoporardıcıllıq.
