Qeyri-üzvi və üzvi mühitlər tərəfindən işığın udulması və sonrakı təkrar emissiyası fosforesensiyanın və ya flüoresansın nəticəsidir. Hadisələr arasındakı fərq işığın udulması və axının emissiyası arasındakı intervalın uzunluğudur. Floresensiya ilə bu proseslər demək olar ki, eyni vaxtda və fosforessensiya ilə müəyyən gecikmə ilə baş verir.
Tarixi məlumat
1852-ci ildə ingilis alimi Stokes flüoresanlığı ilk dəfə təsvir etmişdir. O, yeni termini ultrabənövşəyi işığa məruz qaldıqda qırmızı işıq saçan flüorspatla apardığı təcrübələr nəticəsində ortaya atıb. Stokes maraqlı bir fenomeni qeyd etdi. O, müəyyən etdi ki, flüoresan işığın dalğa uzunluğu həmişə həyəcan işığından daha uzundur.
Fərziyyəni təsdiqləmək üçün 19-cu əsrdə bir çox təcrübələr aparılıb. Onlar göstərdilər ki, müxtəlif nümunələr ultrabənövşəyi işığa məruz qaldıqda flüoresanlaşır. Materiallara, digərləri ilə yanaşı, kristallar, qatranlar, minerallar, xlorofil,dərman xammalı, qeyri-üzvi birləşmələr, vitaminlər, yağlar. Bioloji analiz üçün boyaların birbaşa istifadəsi yalnız 1930-cu ildə başladı
Flüoresan mikroskop təsviri
20-ci əsrin birinci yarısında tədqiqatda istifadə olunan bəzi materiallar çox spesifik idi. Kontrast üsullarla əldə edilə bilməyən göstəricilər sayəsində flüoresan mikroskopiya üsulu həm biotibbi, həm də bioloji tədqiqatlarda mühüm alətə çevrilmişdir. Əldə edilən nəticələr materialşünaslıq üçün heç də az əhəmiyyət kəsb etmirdi.
Flüoresan mikroskopiyanın üstünlükləri nələrdir? Yeni materialların köməyi ilə yüksək spesifik hüceyrələri və submikroskopik komponentləri təcrid etmək mümkün oldu. Floresan mikroskop fərdi molekulları aşkar etməyə imkan verir. Müxtəlif boyalar eyni zamanda bir neçə elementi müəyyən etməyə imkan verir. Avadanlığın məkan ayırdetmə qabiliyyəti difraksiya həddi ilə məhdudlaşsa da, bu da öz növbəsində nümunənin spesifik xüsusiyyətlərindən asılıdır, bu səviyyədən aşağı molekulların aşkarlanması da olduqca mümkündür. Müxtəlif nümunələr şüalanmadan sonra avtoflüoressensiya nümayiş etdirir. Bu fenomen petrologiya, botanika, yarımkeçirici sənayedə geniş istifadə olunur.
Xüsusiyyətlər
Heyvan toxumalarının və ya patogen mikroorqanizmlərin tədqiqi çox vaxt ya çox zəif, ya da çox güclü qeyri-spesifik avtoflüoresans ilə çətinləşir. Bununla belə, dəyəritədqiqat müəyyən dalğa uzunluğunda həyəcanlanan və tələb olunan intensivliyin işıq axını yayan komponentlərin materialına daxil edilməsini əldə edir. Flüoroxromlar strukturlara (görünməz və ya görünən) öz-özünə yapışa bilən boyalar kimi çıxış edir. Eyni zamanda, onlar hədəflərə və kvant məhsuldarlığına görə yüksək seçmə qabiliyyəti ilə seçilirlər.
Flüoresan mikroskopiya təbii və sintetik boyaların meydana çıxması ilə geniş istifadə edilmişdir. Onların xüsusi emissiya və həyəcan intensivliyi profilləri var idi və xüsusi bioloji hədəflərə yönəldilmişdir.
Fərdi molekulların identifikasiyası
Çox vaxt ideal şəraitdə tək elementin parıltısını qeyd edə bilərsiniz. Bunu etmək üçün, digər şeylər arasında, kifayət qədər aşağı detektor səs-küyü və optik fon təmin etmək lazımdır. Bir flüoresan molekulu fotoağartma səbəbiylə məhv edilməzdən əvvəl 300.000-ə qədər fotonu buraxa bilər. 20% toplama dərəcəsi və proses səmərəliliyi ilə onlar təxminən 60 min
məbləğində qeydə alına bilər.
Uçqun fotodiodlarına və ya elektron çoxalmasına əsaslanan flüoresan mikroskop tədqiqatçılara ayrı-ayrı molekulların davranışını saniyələr, bəzi hallarda isə dəqiqələr ərzində müşahidə etməyə imkan verdi.
Çətinliklər
Əsas problem optik fondan səs-küyün yatırılmasıdır. Filtrlərin və linzaların tikintisində istifadə olunan bir çox material müəyyən avtoflüoresans nümayiş etdirdiyinə görə, ilkin mərhələdə alimlərin səyləriaşağı flüoresan olan komponentlər. Lakin sonrakı təcrübələr yeni nəticələrə gətirib çıxardı. Xüsusilə, ümumi daxili əksiyə əsaslanan flüoresan mikroskopiyanın aşağı fon və yüksək həyəcanlı işıq çıxışı əldə etdiyi aşkar edilmişdir.
Mexanizm
Tam daxili əksə əsaslanan flüoresan mikroskopiyanın prinsipləri sürətlə çürüyən və ya yayılmayan dalğadan istifadə etməkdir. Müxtəlif refraktiv indeksləri olan media arasındakı interfeysdə yaranır. Bu halda işıq şüası prizmadan keçir. Yüksək sındırma indeksinə malikdir.
Prizma sulu məhlula və ya aşağı parametrli şüşəyə bitişikdir. İşıq şüası ona kritikdən daha böyük bir açı ilə yönəldilirsə, şüa tamamilə interfeysdən əks olunur. Bu fenomen, öz növbəsində, yayılmayan dalğanın yaranmasına səbəb olur. Başqa sözlə, 200 nanometrdən az məsafədə daha aşağı sındırma indeksinə malik mühitə nüfuz edən elektromaqnit sahəsi yaranır.
Yayılmayan dalğada işığın intensivliyi flüoroforları həyəcanlandırmaq üçün kifayət qədər olacaq. Bununla belə, son dərəcə dayaz dərinliyinə görə onun həcmi çox kiçik olacaqdır. Nəticə aşağı səviyyəli fondur.
Modifikasiya
Tam daxili əksə əsaslanan floresan mikroskopiya epi-işıqlandırma ilə həyata keçirilə bilər. Bunun üçün artan ədədi diyaframı olan linzalar (ən azı 1,4, lakin 1,45-1,6-ya çatması arzu edilir), həmçinin aparatın qismən işıqlandırılmış sahəsi tələb olunur. Sonuncu kiçik bir ləkə ilə əldə edilir. Daha çox vahidlik üçün nazik bir üzük istifadə olunur, bunun vasitəsilə axının bir hissəsi bloklanır. Tam əks olunduqdan sonra kritik bucaq əldə etmək üçün linzalarda və mikroskopun qapaq şüşəsindəki immersion mühitin yüksək dərəcədə sınması lazımdır.
